Binucleación y multinucleación

La multinucleación es la presencia de 2 o más núcleos en unacélula. La observación de la multinucleación en los embriones ya está descrita como un parámetro muy útil para seleccionar los embriones de mejor pronóstico evolutivo.

En nuestro laboratorio estudiamos de forma retrospectiva las posibles diferencias en el desarrollo embrionario de los embriones multinucleados según presenten los blastómeros dos núcleos de igual (bi) o distinto (mn) tamaño. Se han analizado retrospectivamente 596 ciclos de FIV/ICSI (6.088 embriones):

De los 6088 embriones analizados, el 9,1% presentan algún tipo de multinucleación en día 2 de desarrollo embrionario, siendo los dos patrones más frecuentes la binucleación (49,4%) y la multinucleación (22,8%). Otros patrones como la combinación bi/mn o la presencia de micronúcleos son menos frecuentes (<3%).

El número de células es D2 y D3 es significativamente menor en los embriones que presentan al menos una célula multinucleada, siendo incluso menor el número de células de los embriones mn (2,8) vs los bi (3,2).

En cuanto al desarrollo embrionario hasta blastocisto, los embriones mononucleados se desarrollan mejor hasta blastocisto (64,7%) que los que presentan multinucleación, ya sean bi (45,2%) o mn (54,1%)

Al analizar la tasa de implantación no encontramos variaciones en los resultados obtenidos al transferir embriones mononucleados, aunque la cohorte de origen tuviera algún embrión multinucleado. Pero si al menos uno de los embriones transferidos presentaba blastómeros multinucleados en D2 la tasa de implantación cae del 32,8% al 23,9% en el caso de embriones bi y al 0% en el caso de transferir embriones mn (aunque n= 11, p<0,01).

Observar el patrón de multinucleación en D2 es una herramienta útil para seleccionar los embriones con mejor potencial. Siempre que sea posible deberíamos elegir para la transferencia embriones mononucleados y, sobre todo, no deberíamos transferir embriones con varios núcleos de distinto tamaño.

Por ARANCHA GALÁN

Biólogo

Laboratorio Fiv

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Biopsia de testículo
1º) El urólogo junto con la persona que instrumenta desinfectan y anestesian la zona testicular para proceder posteriormente a la incisión en uno de ellos. 
Una vez realizado el pequeño cortese toma una o varias muestras del testículo y se recogen en una placa con medio, para analizar.

2º) Una vez recogida la muestra en la placa, con una hoja de bisturí cortamos todo el tejido y agitamos con precaución la placa para que los espermatozoides que hayan podido quedarse atrapados en las células y microtúbulos  puedan salir.
3º) Buscamos en un microscopio invertido los espermatozoides e informaremos al urólogo del resultado.

5º)  Dejamos 20 minutos en el incubador, esperando que los espermatozoides terminen de salir de los microtúbulo, y centrifugaremos para concentrar la muestra para su posterior ICSI o su congelación.


Por María Pons

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Uso de la ciencia para crear embriones de esperanza: Caso Clínico
Habitualmente a nuestra clínica llegan pacientes con intención de solucionar sus problemas de fertilidad, en ocasiones relacionados con alteraciones génicas o cromosómicas. El tratamiento específico en estos casos es el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) mediante PCR o CGH-ARRAY, estudiando al menos una célula de cada embrión analizado. 

En determinados casos, es necesario solicitar pruebas y autorizaciones específicas que hacen del mismo un proceso muy largo. Por ejemplo, el caso de una pareja con una hija que manifiesta Anemia de Fanconi A, una enfermedad cuyo único tratamiento es el trasplante alogénico de médula ósea y HLA compatible. Tras recibir los permisos necesarios por parte del Organismo Nacional de Trasplantes y de la Comisión Nacional de Reproducción Humana (CNRHA), nuestro objetivo será obtener mediante el uso de la reproducción asistida, descendencia sana y HLA compatible para curar a su hermana enferma. 

Para ello necesitamos prueba de informatividad debido a la consaguinidad de la pareja y muestra de sangre en EDTA de ambos y de la niña. 

Después de obtener todos los consentimientos y la resolución positiva por parte de la CNRHA, comenzamos con el tratamiento de reproducción asistida. Se realizan un total de 4 ciclos de estimulación pero debido a la singularidad del caso, solo conseguimos transferencia embrionaria en 2 de los tratamientos. 

En el primer ciclo se obtienen 12 ovocitos, 11 de los cuales son maduros. De los 9 ovocitos fecundados, se biopsiaron 4 embriones. Transferimos un embrión normal y HLA compatible con la hermana. El resto de embriones son todos sanos para la anemia de Fanconi, dos homocigóticos normales y uno portador. Se congelan. Nueve días después se realiza la beta, resultando positiva. A los 10 días vienen a ecografía, donde no se visualiza saco gestacional. Tras el descenso de la beta, confirmamos que se trata de un aborto. 

En el segundo y tercer ciclo contamos con 15 y 8 ovocitos maduros respectivamente de los cuales se obtienen 1 y 3 embriones sanos pero no compatibles. Los pacientes solo quieren embriones compatibles, así que serán congelados y se realizarán un nuevo ciclo. 

Tras los ciclos previos fallidos, la pareja decide que éste será su último intento, además acceden a transferirse embriones sanos aunque no sean compatibles con su hija. Tras realizar la punción folicular, se obtienen15 ovocitos de los cuales 12 son maduros y microinyectados. Todos fecundan pero sólo 7 se biopsian. Una vez analizados, tenemos un embrión normal portador sanoy compatible que será transferido y 4 congelados. Al realizar la prueba en orina, se obtiene un resultado positivo. Pocos días después, en ecografía se observa saco gestacional de 36 milímetros, vesícula vitelina de 6,5 mm, CRL de 17,5 mm con latido cardiaco fetal positivo. Gestación única a la espera de recién nacido vivo. 

La fusión de las técnicas de reproducción asistida, junto con la citogenética molecular, nos han permitido conseguir una gestación, cuyo objetivo será servir de curación a su hermana enferma. Esto hubiera sido imposible sin el uso de estas técnicas.


David Cernuda

Laboratorio de Fish

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El trasplante de útero

En los últimos años la Medicina no solo ha abarcado el trasplante de órganos de carácter vital para el paciente como el trasplante cardiaco, pulmonar, renal… sino que ha ido más allá realizando trasplantes con el objetivo de mejorar la calidad de vida del paciente.

En esta línea se realizan trasplantes de córnea, de brazo, de cara… el trasplante de útero es un avance prometedor que permitiría conseguir  un embarazo a mujeres que sufren  infertilidad por un factor  uterino primario. Constituye la única opción de alcanzar la maternidad en aquellas sociedades en las que no es aceptable la maternidad subrogada. 

 Los estudios epidemiológicos de Sieunarine y cols sugieren unas cifras de 12.000-15.000 mujeres en UK  con infertilidad por factor uterino lo que equivaldría a unos 9.000-11.000 casos en España.

El primer trasplante de útero en humanos lo realiza el equipo de  W. Fageeh en Arabia Saudí el 6 de Abril del  2000, el órgano fue  obtenido de una donante viva de 46 años  histerectomizada por ovarios poliquísticos. La receptora era una mujer de 26 años a quien le había sido retirado el útero por una hemorragia postparto. Lamentablemente  a los 99 días del trasplante se produjo un episodio de trombosis vascular  debida a un deficitario sostén estructural del órgano que condujo a su retirada.

Tras este evento se produce un aumento en experimentación en auto y alo trasplante de útero en distintos modelos animales como oveja, cerdo, rata… llegándose a obtener gestaciones y nacimientos.  Esta experimentación en modelos animales permite obtener valiosa información para optimizar y poder superar  los principales escollos en el trasplante de útero.

El siguiente intento lo realiza el equipo de Omer Ozkan en Turkía el 9 de Agosto del 2011, en este caso el origen era una donante multiorgánico en muerte cerebral, en este caso la paciente tuvo reglas desde el 2º mes del trasplante y hasta la fecha no muestra signos de rechazo.

Previamente a la realización del trasplante la paciente fue sometida a varios ciclos de FIV vitrificando embriones. Está proyectado que comience  a realizarse la transferencia de embriones vitrificados a partir de Septiembre de 2012.

En septiembre de este año 2012 se ha dado otro importante paso, en la Universidad de Gotemburgo el equipo de Mats Brännström ha llevado a cabo los dos primeros trasplantes de útero de madre a hija. En los próximos meses este equipo médico realizará 8 trasplantes más.

Este equipo médico perseguía este objetivo tras más de 10 años de desarrollo del proyecto con numerosas pruebas en animales. 

Estas mujeres trasplantadas se sometieron previamente a tratamiento de fecundación in vitro y se vitrificaron sus embriones para que una vez transcurra un año desde trasplante y se pueda reducir la medicación inmunosupresora realizar las transferencias de embriones congelados. Teóricamente las posibilidades de  alcanzar la gestación son similares a las de cualquier mujer que se someta a un tratamiento de FIV, entre un 25-30%.

Está prevista la retirada del útero trasplantado cuando tengan un máximo de dos niños.

La experimentación animal ha permitido superar los principales desafíos en el trasplante de útero.

La Técnica del Trasplante.

El Daño isquémico del órgano trasplantado

El control del Rechazo y la inmunosupresión y su posible efecto sobre feto.

 

Técnica de Transplante: Extracción, Fijación del órgano y perfusión.

La técnica de extracción del órgano ha sido desarrollada en animales, consiste en una disección retroperitoneal de los ligamentos suspensorios  y de los  vasos. El flujo sanguíneo se asegura a través de las arterias uterinas.

En donantes fallecidos es posible ampliar el pedículo vascular pero en donantes vivos hay que mantener un fino equilibrio entre la longitud y anchura de las arterias a anastomosar y el posible daño a la donante. Este es un punto crítico ya que tanto en las experiencias con animales como en humanos la tendencia a la formación de trombos es elevada.

Una correcta fijación del útero comprende la anastomosis del borde vaginal del órgano donado con la bóveda vaginal de la receptora y la unión de ligamentos redondos a la pelvis así como ligamentos uterosacros y cardinales. Se postula la fijación del órgano a la pared abdominal anterior como un soporte estructural extra.

Los cambios estructurales y de flujo sanguíneo que se producen durante la gestación suponen un desafío que requiere especial atención a fijación y perfusión del órgano trasplantado.

El Daño isquémico del órgano trasplantado

La isquemia que sufre el órgano durante su extracción así como durante su reperfusión puede generar alteración del parénquima, vasoconstricción, inflamación… favoreciendo así posibilidad de rechazo. Para evitar daños desde la extracción hasta el trasplante el órgano se mantiene en frío en solución buffer tipo University of Wisconsin (UW) o Histidina-Triptófano-Glutarato (HTG).

Este no parece un problema difícil de superar, la experimentación animal  ha demostrado viabilidad de tejido y consecución de embarazo tras 24h de isquemia en frío y en humanos no se han observado alteraciones tisulares tras 12 horas de  protección en buffer UW.

El control del Rechazo y la inmunosupresión y su posible efecto sobre feto.

La terapia inmunosupresora a emplear en un trasplante de útero sería la misma a emplear en otros trasplantes altamente inmunogénicos como cara o mano.

Consiste en una terapia que se inicia con una Inmunoglobulina antitimocito para disminuir el número de linf T previo trasplante seguida de una terapia combinada de Ciclosporina (CsA)/Tacrolimus, corticoides y una agente antiproliferativo como micofenolato de mofetilo.

Los posibles episodios de rechazo agudo se pueden controlar con Ac antitimocito.

La compatibilidad de HLA (sobre todo de HLA-D) es siempre un factor deseable aunque existen numerosos tipos de trasplante en los que la compatibilidad no es imprescindible (hígado, corazón…).

Teniendo en cuenta que en el caso del trasplante uterino el órgano será retirado tras la consecución de como máximo dos gestaciones en el caso del segundo trasplante uterino en humanos el grupo de Ozkam estimó suficiente una compatibilidad de HLA de 3/6 entre donante y receptor sin hasta el momento signos de rechazo alguno bajo terapia inmunosupresora.  La incidencia de la compatibilidad de antígenos HLA en trasplante uterino en el ser humano está por dilucidar.

Uno de los aspectos más polémicos del trasplante de útero son los posibles efectos negativos de la terapia inmunosupresora en el feto durante el embarazo.

La FDA cataloga como tipo B (no evidencia de riesgo) y a los corticoides durante embarazo y en categoría C (no se puede garantizar ausencia de riesgo) a CsA, Tacrolimus, mycofenolato de mofetilo.

Tras un año del trasplante de útero se podrá disminuir la dosis de inmunosupresores y acometer las tentativas de embarazo con la transferencia de embriones congelados.

La seguridad del embarazo y los inmunosupresores está abalada por más de 14.000 nacimientos en madres trasplantadas de órgano sólido.

La experiencia de estas gestaciones sugiere que existe un riesgo mayor de bajo peso del neonato e hipertensión para la madre pero no mayores tasas de malformaciones. Incluso se ha concluido en una revisión de Bjog y cols del 2005 que este mayor riesgo de preeclamsia y bajo peso de neonato pudiera deberse a la morbilidad de la enfermedad de la madre más que al tratamiento inmunosupresor.

Tratamiento de Reproducción Asistida:

 Las técnicas de reproducción asistida pueden ayudar a convertir el trasplante de útero en una alternativa  real a la infertilidad primaria por factor uterino.

La estrategia pasaría por llevar a cabo estas técnicas previamente a la realización del trasplante y vitrificar los embriones para una transferencia de embriones desvitrificados cuando haya transcurrido un año desde el trasplante y se pueda reducir la dosis de inmunosupresores.

Un ciclo de reproducción asistida posterior al trasplante sería más arriesgado ya por la alteración de la anatomía vascular, el mayor riesgo de infecciones a causa de la inmunosupresión además de la posible reducción de la fertilidad por el tratamiento inmunosupresor. La estimulación ovárica puede además predisponer a un aumento de la coagulabilidad y favorecer la aparición de trombos en los puntos anastomosados.

Conclusiones:

Los avances en el control inmunológico y en las técnicas quirúrgicas han hecho posibles los primeros casos de embarazos y recién nacidos vivos en animales con trasplante de útero  alogénico.

La información adquirida con la experimentación animal ha sido clave en el desarrollo de las habilidades técnicas que han permitido la consecución de los primeros trasplantes de útero en humanos con éxito.

El proyecto de transplante uterino alogénico con fines reproductivos en humanos será una realidad en un futuro no muy lejano con la consecución del primer embarazo tras transferencia de embriones desvitrificados en estos primeros casos de trasplante uterino de los equipos de Ozkan y Brännström.

La próxima meta será el control del rechazo del órgano con la mínima inmunosupresión para que tenga el menor impacto posible sobre el desarrollo de la gestación y el feto.

Carlos López

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Investigación sobre  las moléculas del HLA-G y HLA-E

El objetivo de este proyecto es investigar las moléculas del HLA-G y HLA-E desde el punto de vista inmunogenético en las detenciones espontáneas del embarazo en el primer trimestre de la gestación, puesto que ambos antígenos de histocompatibilidad, según la literatura, tienen un papel fundamental en el establecimiento de la tolerancia materno-fetal y en el mantenimiento del embarazo.  Realizan funciones tan importantes como la inmunosupresión de células inmunes maternas para que el feto sea capaz de escapar del ataque del sistema inmunológico materno.

Para la determinación de este objetivo utilizamos muestras de cariotipo embrionario normal, donde se desconoce la causa que llevó a la pérdida de la gestación y utilizamos como grupo de referencia las detenciones espontáneas del embarazo donde se obtiene un cariotipo embrionario anormal, suponiendo que en estos casos la causa del aborto es la anomalía cromosómica. Utilizamos también una novedosa técnica de recogida de muestras como es la histeroembrioscopia, donde la obtención del tejido se realiza de una forma pura y con la mínima contaminación materna posible, dando una mayor fiabilidad al cariotipo fetal.

Por un lado quisimos determinar la distribución de determinados polimorfismos del HLA-G en nuestra población de estudio, así como la presencia o ausencia de un determinado polimorfismo en muestras de trofoblasto embrionario de pacientes con abortos espontáneos de primer trimestre de cariotipo normal y compararla con los polimorfismos de las pacientes con embarazos de cariotipo anormal. Además, puesto que se cree que es poco probable que un único polimorfismo sea capaz de producir la pérdida de la gestación, realizamos la agrupación de los diferentes polimorfismos encontrados en haplotipos con el objetivo de evaluar la distribución en nuestra población de estudio y compararla con nuestro grupo de referencia. No encontramos diferencias significativas entre los dos grupos de comparación en los distintos aspectos analizados.

También, quisimos evaluar el patrón e intensidad de expresión de los antígenos de histocompatibilidad HLA-G y HLA-E en distintos tejidos como trofoblasto embrionario, líquido amniótico y sobrenadantes de medios de cultivo de trofoblasto procedentes de gestaciones detenidas de cariotipo normal y los resultados fueron comparados con los de las muestras de cariotipo anormal. No encontramos diferencias significativas entre los dos grupos de comparación en los distintos aspectos analizados.

Por último, quisimos determinar la relación entre los polimorfismos analizados en la región genética del HLA-G, asociados previamente en otros estudios a la alteración de la expresión de HLA-G, así como los haplotipos generados mediante dichos polimorfismos, y la expresión proteica de esta molécula de sistema inmune en la superficie celular del trofoblasto embrionario, para intentar evaluar la influencia que un determinado polimorfismo o un haplotipo puede tener sobre la secreción proteica. No se encontró ninguna asociación entre los polimorfismos del HLA-G y la alteración de su expresión proteica. Así como no se encontró ninguna asociación entre los haplotipos generados conforme a los polimorfismos del HLA-G y la alteración de su expresión proteica.

Arancha Galán

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